DNA凝膠回收總踩坑？操作步驟及常見問題解析看這里

在分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，基因克隆、基因表達(dá)分析、PCR產(chǎn)物驗(yàn)證等實(shí)驗(yàn)對(duì)DNA樣本的純度與完整性要求較高。DNA凝膠回收作為獲取高純度目標(biāo)DNA片段的關(guān)鍵技術(shù)，其標(biāo)準(zhǔn)化操作流程與實(shí)驗(yàn)耗材的選擇，對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利開展具有重要影響。

從樣本預(yù)處理、DNA吸附洗脫到雜質(zhì)去除的每個(gè)環(huán)節(jié)，不僅需要科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)牟僮鞑襟E，還需優(yōu)質(zhì)的適配實(shí)驗(yàn)耗材，以有效降低樣本損失與外源污染風(fēng)險(xiǎn)。愛津生物純化柱憑借其可靠的性能表現(xiàn)，可在DNA凝膠回收流程中發(fā)揮重要作用，為科研工作者提供實(shí)驗(yàn)支持。

01 實(shí)驗(yàn)原理剖析

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳后，按分子量大小被分開，排列在凝膠中，跟DNA Marker分子量的對(duì)比下，找到目的DNA帶所在的凝膠，并把它切下來，加熱或用特殊的試劑熔解凝膠，使DNA溶回到溶液中，再經(jīng)過乙醇沉淀或過柱即可獲得目的DNA片段。

02 實(shí)驗(yàn)操作流程

① 樣本預(yù)處理與結(jié)合緩沖液混合

將PCR反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至1.5mL微量離心管，按1:3比例加入Binding Buffer I。

② DNA吸附與初步離心

將純化柱置于一個(gè)2mL收集管中，將上一步驟的混合液轉(zhuǎn)移至純化柱中，室溫豎直放置2分鐘，隨后以8000 rpm的轉(zhuǎn)速離心1分鐘。

③ 首次洗滌雜質(zhì)去除

棄去收集管中的液體，向純化柱中加入500μL Wash Solution，12000 rpm離心1分鐘，棄去收集管中的液體，將純化柱放回原來的收集管中。愛津純化柱可提供裝配優(yōu)質(zhì)玻璃纖維膜，在洗滌過程中既能高效截留DNA，性能穩(wěn)定，重復(fù)性好，確保DNA純度。

④ 二次洗滌深度凈化

再次添加500μL Wash Solution到純化柱中，12000 rpm離心1分鐘。棄去收集管中的液體，隨后再次離心，去除殘留的Wash Solution。

⑤ DNA洗脫與保存

將純化柱轉(zhuǎn)移至干凈的1.5mL微量離心管，在純化柱膜中央加入30 - 50μL Elution Buffer，50℃溫浴2分鐘。12000 rpm離心1分鐘，將PCR產(chǎn)物置于-20℃冷凍保存或立即試用。愛津純化柱可實(shí)現(xiàn)輕松單手開合，且密封性強(qiáng)，有效避免樣本在操作過程中受到污染。

03 常見問題深度剖析與解決方案

① 目的產(chǎn)物回收率低

問題原因

? 紫外燈下切膠操作耗時(shí)過長，導(dǎo)致核酸長時(shí)間暴露于紫外輻射，分子結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，從而失去功能；

? 電泳時(shí)所使用的緩沖液長期未更換，pH值發(fā)生改變，影響DNA吸附。

解決方法

? 優(yōu)化切膠流程，縮短紫外照射時(shí)間；

? 定期更換電泳緩沖液，確保其pH值處于適宜范圍。

② 洗脫效率低

問題原因

? 洗滌步驟后，殘留乙醇未充分揮發(fā)，阻礙DNA從純化柱膜上洗脫；

? Elution Buffer未準(zhǔn)確滴加至膜上，導(dǎo)致DNA溶解不充分。

解決方法

? 溶液轉(zhuǎn)移至純化柱加入Wash Solution離心兩次后，需將裝有純化柱的管蓋打開靜置，使殘留乙醇充分揮發(fā)；

? 添加Elution Buffer時(shí)，必須確保緩沖液直接滴在膜上。

③ 瓊脂糖凝膠未完全融化

問題原因

? 55℃水浴溶膠過程中，凝膠未充分混勻，導(dǎo)致局部未完全溶解；

? 膠塊體積過大，不僅會(huì)降低溶膠效率，導(dǎo)致溶液pH值異常，還可能使溶液顏色發(fā)生改變。

解決方法

? 溶膠時(shí)多次上下顛倒使凝膠充分融化混勻，確保無固體瓊脂糖殘留，膠溶化后，一般情況下，將呈現(xiàn)淡黃色或幾乎無色；

? 若膠塊過大，可適當(dāng)增加溶膠液用量，直至溶液顏色恢復(fù)正常。

④ 凝膠切塊過大

問題原因

未精準(zhǔn)切除不含目的片段的瓊脂糖凝膠，導(dǎo)致凝膠體積過大，增加后續(xù)處理難度，影響DNA回收率與純度。

左側(cè)為合適大小的膠塊，右側(cè)為體積過大的膠塊

解決方法

仔細(xì)辨別目的條帶，盡可能切除多余凝膠，減小凝膠體積，提高 DNA回收效率與純度。

⑤ 外源DNA污染

問題原因

實(shí)驗(yàn)環(huán)境清潔度不達(dá)標(biāo)，操作過程未嚴(yán)格遵循無菌操作規(guī)范，導(dǎo)致外源DNA混入樣本。

解決方法

確保實(shí)驗(yàn)在潔凈環(huán)境中進(jìn)行，嚴(yán)格執(zhí)行無菌操作流程，減少外源DNA污染風(fēng)險(xiǎn)。

04 注意事項(xiàng)

① 試劑使用規(guī)范

要嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，例如Wash Solution中是否需要加入一定體積的無水乙醇，體積數(shù)目根據(jù)試劑盒試劑要求而定等。

② 安全防護(hù)措施

核酸染料多具有潛在毒性，操作過程中需佩戴手套、護(hù)目鏡等防護(hù)裝備，規(guī)范處理廢棄物，避免環(huán)境污染與人體傷害。

05 相關(guān)產(chǎn)品推薦-愛津純化柱

在DNA凝膠回收實(shí)驗(yàn)常遇回收率不理想、樣本易受污染等情況時(shí)，愛津純化柱以多項(xiàng)性能優(yōu)勢，為實(shí)驗(yàn)順利開展提供可靠支持。

? 采用符合USP Class VI標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)口高分子聚丙烯（PP）材質(zhì)，無熱原、無內(nèi)毒素、無DNase/RNase；

? 壁厚均勻，高速離心不爆管，安全可靠；

? 可承受高速離心，最大離心力可達(dá)24000xg；

? 高精度模具生產(chǎn)，無表面涂層，不會(huì)污染樣品；

? 可輕松單手打開和關(guān)閉，密封嚴(yán)實(shí)；

? 可提供裝配優(yōu)質(zhì)玻璃纖維膜，提取得率高，性能穩(wěn)定，重復(fù)性好，適用于PCR、酶切、測序、雜交等各種實(shí)驗(yàn)操作。